Ⅰ型胶原修饰纯钛片促进人脂肪间充质干细胞增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (25): 4032-4037.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.017

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Ⅰ型胶原修饰纯钛片促进人脂肪间充质干细胞增殖

叶川¹，马敏先²，张弢³，汤晋1，孙博¹，杨龙¹，任厚相¹，孙琦¹，杨静²，张俊标²

贵阳医学院附属医院，1骨科，2口腔修复科，贵州省贵阳市 550004；3解放军第117医院骨科，浙江省杭州市 310013

收稿日期:2014-05-14 出版日期:2014-06-18 发布日期:2014-06-18
作者简介:叶川，男，1975年生，四川省成都市人，汉族，2008年中南大学湘雅医学院毕业，博士，副教授，主要从事骨关节外科工作。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81360232)；贵州省国际科技合作项目(黔科合外G字2010-7)；贵州省科技厅社发联合基金项目(黔科合20103166)；贵州省科学技术基金(黔科合J字20102177)；贵州省科技厅资助项目(LG2012008)

Type I collagen modified titanium sheet improves the proliferation of human adipose-derived mesenchymal stem cells

Ye Chuan¹, Ma Min-xian², Zhang Tao³, Tang Jin¹, Sun Bo¹, Yang Long¹, Ren Hou-xiang¹, Sun Qi¹, Yang Jing², Zhang Jun-biao²

1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 3Department of Orthopedics, the 117 Hospital of PLA, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China

Received:2014-05-14 Online:2014-06-18 Published:2014-06-18
About author:Ye Chuan, M.D., Associate professor, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360232; International Science and Technology Cooperation Project of Guizhou Province, No. 2010-7; the Joint Social Development Foundation of Science and Technology Bureau of Guizhou Province, No. 20103166; Science and Technology Foundation of Guizhou Province, No. 20102177; the Project of Guizhou Provincial Science and Technology Bureau, No. LG2012008

摘要/Abstract

摘要：

背景：钛及钛合金在人工关节、骨折固定、口腔种植等临床领域应用最多，但在这些领域都存在骨量不足的复杂病例，干细胞研究的深入为骨缺损提供了促进新骨生成的解决方案，钛和干细胞的生物相容性以及钛表面改性优化等问题已引起重视。
目的：观察Ⅰ型胶原修饰纯钛片后能否改善其与人脂肪间充质干细胞的生物相容性。
方法：实验分为2组，修饰组用Ⅰ型胶原修饰纯钛片，未修饰组为未用Ⅰ型胶原修饰的纯钛片，分别将第6代人脂肪间充质干细胞种植于两组钛片上。分别计算细胞种植于两组钛片上1，2，4 h贴壁细胞的数量，比较两组细胞的黏附率。MTT比色法比较细胞种植于两组钛片上2，4，6，8 d细胞在钛片上的增殖情况。比较细胞种植于两组钛片上3，6，9 d细胞的DNA和蛋白含量。将人脂肪间充质干细胞分别接种于修饰组和未修饰组钛片，细胞种植于两组钛片上6 d时，电镜扫描观察细胞在两组钛片上的生长情况。
结果与结论：修饰组的细胞黏附率在培养1，2 h时高于未修饰组(P < 0.05)。MTT比色法显示，修饰组和未修饰组细胞的吸光度值均随培养时间延长而增高，培养第4，6，8天修饰组吸光度值较未修饰组明显升高 (P < 0.05)。培养第6，9天，修饰组的DNA和蛋白含量均高于未修饰组(P < 0.05)。电镜扫描观察显示，培养第6天，修饰组在细胞贴壁数量、贴壁细胞基质分泌情况明显好于未修饰组。结果证实，Ⅰ型胶原修饰纯钛片的表面活性及生物相容性较好，可促进人脂肪间充质干细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, Ⅰ型胶原/钛, 生物相容性, 生物材料, 人脂肪间充质干细胞, 生物相容性, 细胞贴壁率, 流式, 细胞增殖, 体外, DNA含量, 蛋白含量, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Titanium and titanium alloy are used mostly in artificial joints, fracture fixation, and oral transplantation, while there are complex cases of insufficient bone mass in these areas. The deepened research of stem cells offers a solution for bone injury to promote new bone formation. The biocompatibility of titanium and stem cells and optimization of titanium surface modification have aroused people's attention.
OBJECTIVE: To investigate whether the biocompatibility of titanium and human adipose-derived mesenchymal stem cells can be improved by type I collagen modification of titanium sheets.
METHODS: The experiment was divided into two groups. Modification group: titanium sheet was modified with type I collagen; control group: titanium sheet was not modified with type I collagen. Human adipose-derived mesenchymal stem cells at passage 6 were implanted into titanium sheet in two groups. Then we calculated the number of adherent cells in two groups at 1, 2 and 4 hours after implantation, and compared the cell adhesion rate. MTT assay was used to observe the proliferation of cells on titanium sheet at 2, 4, 6 and 8 days after implantation. DNA and protein content of cells were detected at 3, 6, 9 days after implantation. The growth of human adipose-derived mesenchymal stem cells seeded upon the titanium sheets was observed under scanning electron microscope at 6 days.
RESULTS AND CONCLUSION: When the cells were cultured for 1 hour and 2 hours, the number of adherent cells in the modification group was higher than in the control group (P < 0.05). The absorbance of cells in two groups was increased as the culture time, as detected by MTT assay. The modification group had a significantly higher absorbance value than the control group at 4, 6, 8 days (P < 0.05). DNA and protein contents of the cells in the modification group were higher than that in control group at 6 and 9 days (P < 0.05). At 6 days, the number of adherent cells and secretion of adherent stromal cell matrix in the modification group were significantly better than that in control group, observed by scanning electron microscopy. Type I collagen modified titanium sheets have good surface activity and biocompatibility, and can promote the proliferation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: titanium, collagen, mesenchymal stem cells, biocompatible materials

中图分类号:

R318

叶川，马敏先，张弢，汤晋，孙博，杨龙，任厚相，孙琦，杨静，张俊标. Ⅰ型胶原修饰纯钛片促进人脂肪间充质干细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(25): 4032-4037.

Ye Chuan, Ma Min-xian, Zhang Tao, Tang Jin, Sun Bo, Yang Long, Ren Hou-xiang, Sun Qi, Yang Jing, Zhang Jun-biao. Type I collagen modified titanium sheet improves the proliferation of human adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(25): 4032-4037.

图/表（结果） 1

2.1 脂肪间充质干细胞鉴定结果脂肪间充质干细胞培养48 h内大部分贴壁，细胞呈形态较一致的长梭形，随着时间的增加细胞数目亦逐渐增加，原代细胞培养8-10 d融合，排列呈螺旋状、漩涡状。传代细胞培养六七天融合，生长状况良好，见图1A，B。第6代细胞表达间充质干细胞的两个主要表面抗原CD44和CD29，其中CD44细胞为91%，CD29细胞为98%，可以判断其为脂肪间充质来源的干细胞，见图2A，B。

2.2 Ⅰ型胶原/钛改善人脂肪间充质干细胞黏附率变化培养1 h，修饰组和未修饰组黏附率为53%和36%，培养2 h黏附率为79%和62%，两组两个时间点黏附率比较差异有显著性意义(P < 0.05)。修饰组和未修饰组培养4 h黏附率为93%和88%，两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 Ⅰ型胶原/钛改善人脂肪间充质干细胞增殖情况 MTT显示修饰组和未修饰组的吸光度值均随培养时间延长而增高，培养2 d时两组吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)，而在培养4，6，8 d，修饰组吸光度值较未修饰组明显升高(P < 0.05)，见表1。

2.4 Ⅰ型胶原/钛改善人脂肪间充质干细胞DNA和蛋白的表达脂肪间充质干细胞接种于两组钛片上培养3，6，9 d，DNA含量在两组均逐渐增多，修饰组DNA含量在各个时间点均高于未修饰组(P < 0.05)；培养6，9 d，修饰组蛋白含量较未修饰组明显升高(P < 0.05)，见表2。

2.5 Ⅰ型胶原/钛改善人脂肪间充质干细胞超微结构变化第6代脂肪间充质干细胞种植于修饰组和未修饰组培养6 d时，扫描电镜观察见细胞在两组钛片上生长良好，形态呈梭形生长，细胞间连接，见较多基质分泌，见图3。但修饰组细胞生长情况好于未修饰组更为良好。

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引言

自20世纪60年代以来，生物材料在基础研究、临床应用、产业化等方面均得到持续和迅猛的发展，受到各界的高度重视。生物材料是用于人体组织和器官的诊断、修复或改善其功能的一类高技术材料，能修复、取代、替换因疾病失去的人体功能。生物医用金属材料为生物材料的最主要分支，目前得到广泛应用的生物医用金属材料主要有不锈钢、钛及钛合金、钴合金和贵金属等。钛合金由于具有良好的生物相容性、稳定的理化性质、易于加工成形和与骨有着较为接近的弹性模量，使其作为人工关节、骨折固定、脊柱内植物、口腔种植等临床领域应用最多、前途最广阔的生物材料之一。

人工关节初次置换和再次翻修时经常面临结构性骨缺损的疑难情况，通常需要大块植骨以为假体提供牢固的支撑和尽快促进骨整合。组织工程骨的研究为结构性骨缺损提供了完全无免疫原性的、无副损伤的、促进新骨生成的解决方案。而且在骨折固定、口腔种植这些领域都存在骨量不足的复杂病例，干细胞研究的深入为骨缺损提供了促进新骨生成的解决方案，钛和干细胞的生物相容性以及钛表面改性优化等问题已引起重视。Frosch等^[1]认为，用间充质干细胞涂覆的钛植入膝关节的局部，能够缓慢的促进关节表面的骨和软骨再生。脂肪间充质干细胞因为来源广泛、易于获得、具有强大的增殖能力和分化潜能而成为再生医学和组织工程种子细胞的理想选择之一。实验将人脂肪间充质干细胞种植于钛片上，钛表面的改性被认为是改善生物相容性的有效途径^[2-3]，而目前钛表面生物化修饰已成为该领域的热点和难点^[4-5]。对此国内外进行了大量研究，采用基质中的各种活性成分如胶原、生长因子等进行改性，并已取得较为肯定的效果^[6-10]，Huang等^[11]认为，使用磷酸钙和明胶处理过的钛有利于干细胞向成骨细胞分化和提高在体内重建骨的能力，这种处理钛的方法在关节置换或牙科植入物有很好的应用前景；有学者认为，用含钙物质对钛进行表面处理有助于人类间充质干细胞的成骨分化^[12]；还有专家认为，喷砂钛表面使用氟改性后有促进成骨标志物表达的作用^[13]。

Ⅰ型胶原是细胞重要的细胞外基质组成成分，由多种糖蛋白分子组成，免疫原性很低，来源广泛，具有特殊的生物相容性和生物可降解性，参与组织修复，其对细胞的生物学行为具有十分重要的调节作用，有利于细胞的代谢、增殖、分化、迁移及信息传递，是一类优良的可引导组织再生的生物材料。钛合金假体和脂肪间充质干细胞的生物相容性正受到关注。实验用Ⅰ型胶原修饰钛金属，增加其表面活性，研究和优化二者之间的体外生物相容性，为二者进一步的研究和可能的临床转化提供数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：体外观察性实验。

时间和地点：于2012年3月至2013年10月在贵阳医学院组织工程与干细胞中心实验室完成。

材料：

Ⅰ型胶原/钛改善人脂肪间充质干细胞体外生物相容性相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
Ⅰ型胶原、Hoechst33258试剂、MTT	Sigma，美国
DMEM培养基、胎牛血清	Gibco，美国
细胞培养箱	Forma Scientific，美国
酶标光度仪	Bio-Tek El312E，美国
BEIPC荧光分光度计	日立，日本

脂肪标本来源：纳入3例腹部减肥吸脂治疗的患者，女，26-32岁，签署伦理学知情同意书，取吸脂后废弃脂肪约40 g用于后续试验。

纯钛片：购自宝鸡市钛制品有限公司，均切割成 0.5 mm×10 mm×10 mm大小备用。

实验方法：

脂肪间充质干细胞原代、传代及多项分化诱导培养：3例腹部吸脂后废弃脂肪约40 g，PBS冲洗，剪碎至1 mm× 1 mm×1 mm大小，予体积分数0.1%Ⅰ型胶原酶消化至脂肪组织基本液化，过滤以去除残留的筋膜组织，PBS重悬细胞，洗涤，离心，含体积分数10%胎牛血清、青、链霉素的低糖DMEM培养基重悬细胞，取0.2 mL细胞悬液行锥虫蓝染色计算细胞数量和活力，在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下培养，每隔3 d更换1次培养基，第1次为半量换液，随后为全量换液，光学显微镜下观察细胞的生长情况以及形态变化。细胞生长铺满单层时传代培养。

流式细胞仪检测细胞表面CD29和CD44抗原的表达：体积分数0.05%胰蛋白酶和0.53 mmol/L EDTA混合液消化收集传6代细胞，1 200 r/min离心10 min，PBS重悬细胞。调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，分装，分别滴加饱和浓度的抗CD29、CD44兔抗人单克隆抗体，室温反应30 min，洗涤2次，滴加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗兔IgG二抗避光作用30 min，PBS洗涤并重悬细胞，上机进行流式细胞仪分析。

钛片制备及分组：将钛片切割成0.5 mm×10 mm× 10 mm 大小，钛片抛光处理，经丙酮、乙醇、超纯水、超声波清洗机清洗，三蒸水再浸泡24 h后高压蒸汽灭菌。将钛片分为两组：修饰组将无菌钛片浸泡入质量浓度 100 mg/L的胶原溶液中，2 h后取出，室温下干燥；未修饰组未用Ⅰ型胶原处理。

细胞黏附率计算：将两组钛片放入24孔板，不用培养基预湿，将第6代脂肪间充质干细胞用完全培养基重悬，将1×10⁶个细胞种植于钛片上，在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度条件下培养。分别在接种后1，2，4 h时两组钛片各取6片，PBS冲洗后，移入新24孔板，胰酶消化贴壁在钛片上的细胞，血球计数板计数，与初始种植的细胞数相比，得出黏附率。

MTT比色法计算钛片上的细胞增殖情况：将第6代1×10⁵个细胞种植于钛片上，于第2，4，6，8天两组钛片每组各取8片，PBS漂洗后，移入新24孔板，每孔加入质量浓度5 g/L的MTT 80 μL，继续培养4 h，吸去上清，每孔加入720 μL DMSO，振荡15 min，酶联免疫检测仪上波长 570 nm检测各孔吸光度值。

细胞DNA含量测定：采用Hoechst 33258荧光法检测细胞内的DNA含量：将第6代脂肪间充质干细胞5×10⁵个种植于钛片上，于培养第3，6，9天两组钛片每个时间点各取8片。裂解细胞后，取裂解液100 μL加入900 μL Hoechst 33258荧光染液，混匀后放置10 min。将样品放入荧光分光光度计中，在激发波长356 nm、发射波长492 nm下测定荧光强度，以小牛胸腺DNA为标准品参照，得出细胞内DNA浓度。

细胞蛋白含量检测：将第6代脂肪间充质干细胞5×10⁵个种植于钛片上，于培养3，6，9天两组钛片每个时间点各取8片，收集生长于其上的细胞，RIPA细胞裂解液，4 ℃ 30 min裂解细胞，4 ℃ 200×g离心10 min，收集上清，BCA (bicinchonininc acid)法测定裂解液中蛋白浓度。

扫描电镜观察：取培养第6天的修饰组和未修饰组钛片各1片和未做任何处理的纯钛片1片，经体积分数2.5%戊二醛固定、丙酮脱水、临界点干燥、喷金等处理后在扫描电镜下观察细胞在钛片上的生长情况。

主要观察指标：培养的脂肪间充质干细胞鉴定结果，Ⅰ型胶原/钛修饰人脂肪间充质干细胞黏附率，增殖和生物相容性。

统计学处理：计量资料以x(_)±s表示，计数资料以百分率表示，采用SPSS 12.0统计学软件进行数据处理，组间数据差异的比较采用配对t 检验和卡方检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

钛金属具有优良的耐腐蚀性和生物相容性，但生物活性欠佳，即植入后不能很快与人体软组织形成生物整合^[14]。随着研究的不断深入，为了提高钛及钛合金的生物活性，进一步改善钛及钛合金表面活性的相关研究已成为生物材料学科领域中的一大热点。现已发展出多种钛材表面改性方法，包括机械法、物理法、化学法和生物化学法^[15]。生物化学法将能促进细胞识别、黏附、增殖的肽段、蛋白质或生长因子附着在钛表面，来改变所接触的细胞的功能^[16]。

胶原是属于细胞外基质的结构蛋白质，广泛存在于脊椎动物和人的皮肤、肌腱、韧带、软骨及骨等组织或器官中。它的主要成分是糖蛋白。约占机体总蛋白的25%^[17]。胶原具有很好的生物学性能，是目前组织工程研究中最常用的天然生物支架材料。胶原蛋白及相关制品已广泛应用于临床医学中^[18-19]，并且已被美国FDA批准作为人工皮肤材料^[20]。

Ⅰ型胶原作为胶原蛋白最主要的成分，约占胶原蛋白的85%，将其作为组织工程支架材料应用时，研究结果显示其有促进细胞黏附和诱导细胞分化的作用。是良好的培养黏附剂。而且降解产物可被细胞重新利用合成新的基质，不产生毒性代谢产物，不影响内环境pH值，因此不会影响细胞的生长增殖^[21]。Ⅰ型胶原是胶原的主要组成成分，作为体外细胞培养支架时，有促进细胞黏附和诱导生长分化的作用，是良好的培养黏附剂^[21-22]。

细胞骨架中的肌动蛋白是维持细胞形态和细胞附着的结构基础，细胞在材料表面的黏附过程包括血浆蛋白层吸附、细胞接触、附着及伸展4个阶段，细胞黏附率是用来评价细胞对生物材料表面活性的主要指标之一，它是后续细胞伸展、生长和增殖等一系列发展的开始和重要的一环^[23]。实验数据显示脂肪间充质干细胞种植于胶原修饰的钛片后一两小时黏附率都高于未修饰组，这说明Ⅰ型胶原涂层有利于细胞的早期黏附，比未修饰组钛片具有更好的表面活性。

贾帅军等^[24]用Ⅰ型胶原修饰聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙共聚物，证明了Ⅰ型胶原可通过所含的整合素和与骨髓基质干细胞发生相互黏附作用，提高高分子材料表面的表面活性，实现了细胞在三维材料上的良好黏附。已有研究证实Ⅰ型胶原所含的纤维黏连蛋白等黏附分子对细胞黏附具有重要的调控作用^[25]，因此在用Ⅰ型胶原对钛表面进行改性，能在其表面模拟天然细胞外基质的功能和作用，促进所接触的细胞的黏附作用。

细胞在材料上的生长情况是评估材料生物相容性的重要指标，实验采用细胞贴壁法评价材料的生物相容性^[26]。MTT比色法，其原理为线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲瓒，MTT结晶形成量与细胞数成正比，因此可以反映活细胞数量，从而评估细胞的增值能力。

实验中的MTT结果显示人脂肪间充质干细胞接种至钛片上后修饰组和未修饰组上均生长良好，在培养第2天时增殖速度尚无差别，但在培养4 d后Ⅰ型修饰组明显快于未修饰组。同时通过定量测定细胞内DNA和蛋白质含量，发现接种至Ⅰ型修饰组钛片上的细胞内DNA和蛋白质含量均明显高于未修饰组，说明修饰组钛片更能促进细胞生长。扫描电镜观察亦显示，细胞在Ⅰ型胶原钛片上生长时呈特有的梭形形态，能大量分泌基质，证明了Ⅰ型胶原可以促进脂肪间充质干细胞在钛片上的增殖。

既往研究用Ⅰ型胶原单独或修饰β-磷酸三钙层状支架联合骨髓间充质干细胞都成功修复动物关节骨软骨缺损，也证明了Ⅰ型胶原中含有的生长因子和黏附分子，在用Ⅰ型胶原修饰材料后释放出特异性的分子识别信号，能促进细胞黏附的同时还能和促进细胞生长和增殖^[27-29]。

脂肪间充质干细胞是从脂肪中分离出一种细胞，生长稳定，增殖能力强，具有类似于骨髓间充质干细胞的多向分化特性，相比于后者骨髓来源的间充质干细胞，脂肪来源的间充质干细胞相对更为丰富，增殖能力更为强大而成为再生医学和组织工程种子细胞的理想选择之一^[30-31]。

实验用Ⅰ型胶原修饰钛片，观察种植于其上的脂肪间充质干细胞的黏附、生长、增殖、代谢合成等一系列改变，结果显示Ⅰ型胶原涂层的钛合金能显著促进其上的干细胞黏附和生长，提示通过对钛表面的生物学改性，在保持材料本身所具有的物理机械性能的同时能显著改善钛表面的细胞相容性和生物活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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Ⅰ型胶原修饰纯钛片促进人脂肪间充质干细胞增殖

Type I collagen modified titanium sheet improves the proliferation of human adipose-derived mesenchymal stem cells

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